2 × Pfu PGR mišinys

A-1 šablonas

■ Šablone yra baltymų priemaišų arba Taq inhibitorių ir kt. - Išvalykite DNR šabloną, pašalinkite baltymų priemaišas arba ištraukite šablono DNR su valymo rinkiniais.

■ Šablono denatūracija nėra baigta —— Tinkamai padidinkite denatūracijos temperatūrą ir pailginkite denatūracijos laiką.

■ Šablono pablogėjimas-iš naujo paruoškite šabloną.

A-2 gruntas

■ Prasta pradmenų kokybė-pakartotinai sintezuokite pradmenis.

■ Grunto skaidymas —— Konservuoti didelės koncentracijos pradmenis į mažą tūrį. Venkite daugkartinio užšalimo ir atšildymo arba ilgalaikio 4 ° C šalčio.

■ Netinkamas gruntų dizainas (pvz., Nepakankamas grunto ilgis, tarp pradmenų susidaręs dimeris ir pan.)

A-3 Mg²⁺koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija yra per maža - tinkamai padidinkite Mg²⁺ koncentracija: optimizuokite Mg²⁺ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg²⁺ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.

A-4 atkaitinimo temperatūra

■ Aukšta atkaitinimo temperatūra turi įtakos grunto ir šablono surišimui. —— Sumažinkite atkaitinimo temperatūrą ir optimizuokite būklę 2 ° C gradientu.

A-5 Pratęsimo laikas

■ Trumpas pratęsimo laikas - padidinkite pratęsimo laiką.

Fenomenai: neigiami mėginiai taip pat rodo tikslines sekos juostas.

A-1 PGR užteršimas

■ Tikslinės sekos arba amplifikacijos produktų kryžminis užteršimas - atsargiai nepipipiliuokite mėginyje esančio mėginio, kuriame yra tikslinė seka, ir neišpilkite jų iš centrifugos mėgintuvėlio. Reagentai ar įranga turi būti autoklavuojami, kad būtų pašalintos esamos nukleorūgštys, o užterštumas turėtų būti nustatytas atliekant neigiamus kontrolinius eksperimentus.

■ Reagentų užteršimas —— Reagentus išplakite ir laikykite žemoje temperatūroje.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentracija yra per maža - tinkamai padidinkite Mg²⁺ koncentracija: optimizuokite Mg²⁺ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg²⁺ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.

■ Netinkamas pradmenų dizainas ir tikslinė seka yra homologiška su netiksline seka. —— Iš naujo suprojektuoti gruntai.

Reiškiniai: PGR amplifikacijos juostos neatitinka tikėtino dydžio, didelės arba mažos, arba kartais atsiranda tiek specifinių amplifikacijos juostų, tiek nespecifinių amplifikacijos juostų.

A-1 gruntas

■ Prastas grunto specifiškumas

—— naujo dizaino gruntas.

■ Grunto koncentracija yra per didelė —— Tinkamai padidinkite denatūracijos temperatūrą ir pailginkite denatūracijos laiką.

A-2 Mg²⁺ koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija yra per didelė —— Tinkamai sumažinkite Mg2+ koncentraciją: optimizuokite Mg²⁺ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg²⁺ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.

A-3 Termostabili polimerazė

■ Per didelis fermentų kiekis - atitinkamai sumažinkite fermentų kiekį 0,5 V intervalu.

A-4 atkaitinimo temperatūra

■ Atkaitinimo temperatūra yra per žema —— Tinkamai padidinkite atkaitinimo temperatūrą arba naudokite dviejų pakopų atkaitinimo metodą

A-5 PGR ciklai

■ Per daug PGR ciklų - sumažinkite PGR ciklų skaičių.

A-1 gruntas—— prasta specifika —— iš naujo suprojektuokite gruntą, pakeiskite grunto vietą ir ilgį, kad padidintumėte jo specifiškumą; arba atlikti įdėtąjį PGR.

A-2 šablono DNR

—–Šablonas nėra grynas —— Išvalykite šabloną arba ištraukite DNR valymo rinkiniais.

A-3 Mg²⁺ koncentracija

- Mg²⁺ koncentracija yra per didelė - tinkamai sumažinkite Mg²⁺ koncentracija: optimizuokite Mg²⁺ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg²⁺ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.

A-4 dNTP

——DNTP koncentracija per didelė —— Tinkamai sumažinkite dNTP koncentraciją

A-5 atkaitinimo temperatūra

—— Per maža atkaitinimo temperatūra —— Tinkamai padidinkite atkaitinimo temperatūrą

A-6 ciklai

—— Per daug ciklų —— Optimizuokite ciklo skaičių

Pirmasis žingsnis yra pasirinkti tinkamą polimerazę. Įprasta Taq polimerazė negali būti koreguojama, nes trūksta 3'-5 'eksonukleazės aktyvumo, o neatitikimas labai sumažins fragmentų išplėtimo efektyvumą. Todėl įprasta Taq polimerazė negali efektyviai sustiprinti didesnių nei 5 kb tikslinių fragmentų. Taq polimerazė su specialia modifikacija arba kita aukštos tikslumo polimerazė turėtų būti parenkama taip, kad pagerintų pratęsimo efektyvumą ir patenkintų ilgo fragmento amplifikacijos poreikius. Be to, norint sustiprinti ilgus fragmentus, taip pat reikia atitinkamai pakoreguoti pradmenų konstrukciją, denatūracijos laiką, pratęsimo laiką, buferio pH ir tt Paprastai gruntai su 18-24 bp gali duoti geresnį derlių. Siekiant išvengti šablono pažeidimo, denatūracijos laikas 94 ° C temperatūroje per ciklą turėtų būti sutrumpintas iki 30 sekundžių ar mažiau, o laikas iki temperatūros padidėjimo iki 94 ° C iki amplifikacijos turėtų būti trumpesnis nei 1 min. Be to, nustačius pratęsimo temperatūrą apie 68 ° C ir pailginimo laiką suprojektuojant pagal 1 kb/min greitį, galima užtikrinti veiksmingą ilgų fragmentų amplifikaciją.

PGR amplifikacijos klaidų dažnį galima sumažinti naudojant labai tikslias įvairias DNR polimerazes. Tarp visų iki šiol rastų Taq DNR polimerazių Pfu fermentas turi mažiausią klaidų lygį ir didžiausią ištikimybę (žr. Pridedamą lentelę). Be fermentų atrankos, mokslininkai gali dar labiau sumažinti PGR mutacijos greitį, optimizuodami reakcijos sąlygas, įskaitant buferio sudėties optimizavimą, termiškai stabilios polimerazės koncentraciją ir optimizuojant PGR ciklo skaičių.