„TIANSeq“ vieno indekso adapteris („Illumina“)

Šiuo metu didelio našumo sekos nustatymo technologija daugiausia grindžiama naujos kartos sekos technologija. Kadangi naujos kartos sekos nustatymo technologijos skaitymo ilgis yra ribotas, mes turime suskaidyti visą ilgio seką į mažas fragmentų bibliotekas. Atsižvelgdami į skirtingų sekos eksperimentų poreikius, dažniausiai pasirenkame vienpusę seką arba dvipusę seką. Šiuo metu naujos kartos sekos sudarymo bibliotekos DNR fragmentai paprastai yra pasiskirstę 200–800 bp intervale.

a) DNR yra prastos kokybės ir turi inhibitorių. Naudokite aukštos kokybės DNR mėginius, kad išvengtumėte fermentų aktyvumo slopinimo.

b) DNR bibliotekos sudarymui nepakanka DNR mėginio kiekio. Kai suskaidytos DNR įvestis viršija 50 ng, bibliotekos kūrimo metu pasirinktinai gali būti atlikta darbo eiga be PGR. Jei bibliotekos kopijų skaičius yra per mažas, kad būtų galima tiesiogiai sekvenuoti, DNR biblioteką galima sustiprinti PGR po adapterio perrišimo.

c) RNR užteršimas lemia netikslų pradinį DNR kiekybinį nustatymą RNR užteršimas gali egzistuoti genomo DNR valymo procese, o tai gali lemti netikslų DNR kiekybinį nustatymą ir nepakankamą DNR įkėlimą bibliotekos statybos metu. RNR galima pašalinti apdorojant RNaze.

A-1

a) Pasirodo maži fragmentai (60 bp-120 bp) Maži fragmentai paprastai yra adapterio fragmentai arba adapteriai suformuoti dimeriai. Valymas naudojant „Agencourt AMPure XP“ magnetines granules gali efektyviai pašalinti šiuos adapterio fragmentus ir užtikrinti sekos kokybę.

b) Po PGR amplifikacijos bibliotekoje atsiranda dideli fragmentai Bibliotekos DNR fragmento dydis padidės 120 bp po to, kai adapteris bus surištas. Jei DNR fragmentas padidėja daugiau nei 120 bp po adapterio surišimo, tai gali sukelti nenormalus fragmento amplifikacija, per didelė PGR amplifikacija. Sumažinus PGR ciklų skaičių, galima išvengti situacijos.

c) Nenormalus bibliotekos DNR fragmentų dydis po adapterio surišimo Šio rinkinio adapterio ilgis yra 60 bp. Kai du fragmento galai bus prijungti prie adapterių, ilgis padidės tik 120 bp. Jei naudojate ne šio rinkinio adapterį, susisiekite su tiekėju ir pateikite svarbią informaciją, pvz., Adapterio ilgį. Įsitikinkite, kad eksperimento darbo eiga ir veikimas atitinka instrukcijoje aprašytus veiksmus.

d) Nenormalus DNR fragmento dydis prieš prijungiant adapterį Šios problemos priežastis gali būti netinkamos reakcijos sąlygos DNR suskaidymo metu. Skirtingam DNR įvedimui reikia naudoti skirtingą reakcijos laiką. Jei DNR įvestis yra didesnė nei 10 ng, rekomenduojame pasirinkti 12 minučių reakcijos laiką kaip pradinį optimizavimo laiką, o šiuo metu pagaminto fragmento dydis daugiausia yra 300–500 bp. Vartotojai gali padidinti arba sumažinti DNR fragmentų ilgį 2-4 minutes pagal savo poreikius, kad optimizuotų reikiamo dydžio DNR fragmentus.

A-2

a) Fragmentacijos laikas nėra optimizuotas Jei suskaidyta DNR yra per maža arba per didelė, vadovaukitės instrukcijomis pateiktomis fragmentacijos laiko parinkimo gairėmis, kad nustatytumėte reakcijos laiką, ir naudokite šį laiko tašką kaip kontrolę, papildomai nustatykite Reakcijos sistema pailgina arba sutrumpina 3 minutes, kad būtų tiksliau sureguliuotas suskaidymo laikas.

A-3

Nenormalus DNR dydžio pasiskirstymas po apdorojimo suskaidymu

a) Netinkamas suskaidymo reagento atšildymo metodas arba po atšildymo reagentas nėra visiškai sumaišytas. Atšildykite 5 × suskaidymo fermentų mišinio reagentą ant ledo. Atšildžius, tolygiai sumaišykite reagentą, švelniai brūkštelėkite mėgintuvėlio apačioje. Nesukite sūkurinio reagento!

b) DNR įvesties mėginyje yra EDTA ar kitų teršalų. Druskos jonų ir chelatinių medžiagų išeikvojimas DNR valymo etape yra ypač svarbus sėkmingam eksperimentui. Jei DNR ištirpsta 1 × TE, suskaidymui naudokite instrukcijoje pateiktą metodą. Jei EDTA koncentracija tirpale neaiški, rekomenduojama DNR išvalyti ir ištirpinti dejonizuotame vandenyje vėlesnei reakcijai.

c) Netikslus pradinis DNR kiekybinis nustatymas Suskaidytos DNR dydis yra glaudžiai susijęs su įvestos DNR kiekiu. Prieš apdorojant fragmentaciją, norint tiksliai nustatyti DNR kiekį reakcijos sistemoje, būtina tiksliai išmatuoti DNR naudojant Qubit, Picogreen ir kitus metodus.

 d) Reakcijos sistemos paruošimas neatitinka nurodymų. Suskaidytos reakcijos sistemos paruošimas turi būti atliekamas ant ledo griežtai laikantis nurodymų. Siekiant užtikrinti geriausią efektą, visi reakcijos komponentai turi būti dedami ant ledo, o reakcijos sistema turi būti paruošta visiškai atvėsus. Pasibaigus paruošimui, pamuškite arba pipete gerai išmaišykite. Nesukite sūkurio!

1. Netinkamas maišymo metodas (sūkurys, smarkus svyravimas ir kt.) Sukels nenormalų bibliotekos fragmentų pasiskirstymą (kaip parodyta toliau pateiktame paveikslėlyje), taip paveikdamas bibliotekos kokybę. Todėl, ruošdami suskaidymo mišinio reakcijos tirpalą, švelniai pipete pakelkite aukštyn ir žemyn, kad susimaišytų, arba pirštu braukite ir tolygiai maišykite. Būkite atsargūs, kad nemaišytumėte su sūkuriu.

2. Bibliotekos statybai turi būti naudojama didelio grynumo DNR

■ Geras DNR vientisumas: elektroforezės juosta yra daugiau nei 30 kb, be uodegos

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. DNR įvesties kiekis turi būti tikslus DNR kiekybei nustatyti rekomenduojama naudoti Qubit ir PicoGreen metodus, o ne Nanodrop.

4. EDTA kiekis DNR tirpale turi būti nustatytas EDTA turi didelę įtaką suskaidymo reakcijai. Jei EDTA kiekis yra didelis, prieš sekantį tyrimą reikia atlikti DNR valymą.

5. Suskaidymo reakcijos tirpalas turi būti paruoštas ant ledo. Skaidymo procesas yra jautrus reakcijos temperatūrai ir laikui (ypač pridėjus stipriklio). Norėdami užtikrinti reakcijos laiko tikslumą, paruoškite reakcijos sistemą ant ledo.

6. Fragmentacijos reakcijos laikas turi būti tikslus Fragmentacijos etapo reakcijos laikas tiesiogiai paveiks fragmentų produktų dydį ir taip paveiks DNR fragmentų pasiskirstymą bibliotekoje.

1. Kokio tipo mėginys taikomas šiam rinkiniui?

Tinkamas šio rinkinio pavyzdys gali būti visa RNR arba išgryninta mRNR, turinti gerą RNR vientisumą. Jei bibliotekai sukurti naudojama visa RNR, rekomenduojama pirmiausia naudoti rRNR išeikvojimo rinkinį (kat. Nr. 4992363/4992364/4992391), kad pašalintumėte rRNR.

2. Ar FFPE mėginiai gali būti naudojami bibliotekai su šiuo rinkiniu sukurti?

FRPE mėginiuose esanti mRNR tam tikru mastu bus suskaidyta, o santykinai prasta. Naudojant šį rinkinį bibliotekos statybai, rekomenduojama optimizuoti suskaidymo laiką (sutrumpinti suskaidymo laiką arba neatlikti suskaidymo).

3. Kas, naudojant gaminio vadove pateiktą dydžio pasirinkimo žingsnį, gali sukelti nedidelį nukrypimą nuo įterpto segmento?

Dydis turi būti parenkamas griežtai laikantis šio gaminio vadovo dydžio parinkimo žingsnio. Jei yra nukrypimų, priežastis gali būti ta, kad magnetinės granulės nėra subalansuotos iki kambario temperatūros arba nėra visiškai sumaišytos, pipetė nėra tiksli arba skystis lieka antgalyje. Eksperimentui rekomenduojama naudoti antgalius su maža adsorbcija.

4. Adapterių pasirinkimas bibliotekos statyboje

Bibliotekos konstravimo rinkinyje nėra adapterio reagento, todėl šį rinkinį rekomenduojama naudoti kartu su TIANSeq vieno indekso adapteriu („Illumina“) (4992641/4992642/4992378).

5. Bibliotekos QC

Bibliotekos kiekybinis aptikimas: Qubit ir qPCR naudojami atitinkamai bibliotekos masės ir molinei koncentracijai nustatyti. Operacija griežtai atitinka gaminio vadovą. Bibliotekos koncentracija paprastai atitiks NGS sekos nustatymo reikalavimus. Bibliotekos platinimo diapazono aptikimas: naudojant „Agilent 2100 Bioanalyzer“ bibliotekos platinimo diapazonui aptikti.

6. Stiprinimo ciklo numerio pasirinkimas

Remiantis instrukcijomis, PGR ciklų skaičius yra 6–12, o reikalingas PGR ciklų skaičius turi būti parenkamas atsižvelgiant į mėginio įvestį. Didelio našumo bibliotekose paprastai padidėjimas įvyksta įvairaus laipsnio, o tai pasireiškia šiek tiek didesne smailė po tikslinio diapazono piko nustatant „Agilent 2100 Bioanalyzer“, arba nustatyta Qubit koncentracija yra mažesnė nei qPCR. Lengvas per stiprinimas yra normalus reiškinys, kuris neturi įtakos bibliotekų sekos nustatymui ir vėlesnei duomenų analizei.

7. Spygliai pasirodo „Agilent 2100 Bioanalyzer“ aptikimo profilyje

„Agilent 2100 Bioanalyzer“ aptikimo smaigaliai atsirado dėl netolygaus mėginių suskaidymo, kai tam tikro dydžio fragmentų bus daugiau, ir tai taps akivaizdžiau praturtinus PGR. Šiuo atveju siūloma neatlikti dydžio pasirinkimo, ty 15 minučių inkubuojant nustatyti suskaidymo sąlygą iki 94 ° C, kur fragmentų pasiskirstymas yra mažas ir koncentruotas, ir galima pagerinti homogeniškumą.