Kraujo tiesioginio PGR rinkinys

Greitas tikslinio geno amplifikacija tiesiogiai naudojant kraują kaip šabloną be ekstrahavimo.

Šiame rinkinyje yra genetiškai modifikuota anti-inhibitorių DNR polimerazė, skirta veiksmingai sustiprinti vienos kopijos genus žmogaus genome. Šiame rinkinyje gerai optimizuota buferinė sistema padeda polimerazei stipriai atsispirti PGR inhibitorių slopinimui, todėl gali tiesiogiai sustiprinti DNR, naudojant kraują ir kultivuotas ląsteles kaip šablonus. Šis produktas yra lengvai valdomas ir nereikalauja sudėtingų veiksmų, tokių kaip DNR valymas ar išankstinis mėginio apdorojimas.
Šis rinkinys pateikiamas kaip 2 × „MasterMix“, o reakciją galima atlikti tiesiog pridedant kraujo šabloną ir atitinkamus aptikimo pradmenis. Jis gali būti naudojamas ant kultivuotų žinduolių, tokių kaip žmonės, pelės, kiaulės, galvijai ir kitų rūšių ląstelės, taip pat šviežio arba 4 ℃ šaltai konservuoto viso kraujo, antikoagulianto (EDTA, citrato, heparino), suskystintų kraujo krešulių ir sausų kraujo dėmių saugomi „Whatman 903“ ir „FTA Elute“ komercinėse kortelėse.

Katė. Ne	Pakuotės dydis
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

Siųskite mums el

Produkto informacija

Eksperimentinis pavyzdys

DUK

Produkto žymos

funkcijos

■ Paprasta ir greita: PGR amplifikaciją galima atlikti tiesiogiai naudojant kraują kaip šabloną, nereikalaujant varginančių mėginių paruošimo ir DNR ekstrahavimo etapų.
■ Didelio grynumo: praleidus mėginio pirminį apdorojimą ir DNR ekstrahavimo veiksmus, galima išvengti kryžminio mėginių užteršimo.
■ Didelis pralaidumas: didelio masto mėginių PGR identifikavimą galima atlikti derinant rinkinį su 96/384 šulinėlių PGR plokštelėmis.
■ Stiprus universalumas: Šis rinkinys gali efektyviai sustiprinti aukšto GC fragmentus arba sudėtingos antrinės struktūros fragmentus, o amplifikacijos ilgis gali būti iki 5 kb.
■ Stiprus atsparumas stresui: šį rinkinį galima naudoti įvairioms rūšims ir įvairiais būdais išsaugotiems kraujo mėginiams.

Programos

Šio rinkinio PGR produktų 3′ gale yra „A“, kuris gali būti tiesiogiai naudojamas TA vektoriaus klonavimui. Šis rinkinys gali būti naudojamas genomo DNR fragmentų amplifikacijai, didelio našumo genetinei analizei ir genotipų (pvz., Genų aptikimui) analizei.

Visi produktai gali būti pritaikyti ODM/OEM. Norėdami gauti daugiau informacijos,spustelėkite individualų aptarnavimą (ODM/OEM)

Ankstesnis: TIANcombi DNR Lyse & Det PGR rinkinys

Kitas: Tiesioginis pelės audinių PGR rinkinys

	Naudojant žmogaus EDTA antikoaguliaciją kaip šabloną, 4 genai, turintys skirtingą GC turinį, buvo sustiprinti „Blood Direct“ PGR rinkiniu. PGR reakcijos sistema buvo 20 μl, o kaip šablonas buvo naudojamas 1 μl kraujo. M: TIANGEN žymeklis II; 1: fragmento dydis 1090 bp, GC kiekis 68,1%; 2: fragmento dydis 1915 bp, GC kiekis 70,4%; 3: fragmento dydis 448 bp, GC kiekis 74,8%; 4: fragmento dydis 1527 bp, GC kiekis 61,5%. Eksperimentiniai rezultatai: „Blood Direct“ PGR rinkinys gali veiksmingai sustiprinti DNR fragmentus, kurių GC kiekis yra 61,5–74,8%, o tai rodo, kad jis gali sustiprinti didelio GC fragmentus.
	Naudojant žmogaus EDTA antikoaguliaciją kaip šabloną, 5 skirtingo ilgio genai (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 ir Hn4.0) buvo sustiprinti „Blood Direct“ PGR rinkiniu. PGR reakcijos sistema buvo 20 μl, o kaip šablonas buvo naudojamas 1 μl kraujo. M: TIANGEN žymeklis II; 1-3: 3 skirtingi kraujo mėginiai; NTC: valdymas be pradmenų. Eksperimentiniai rezultatai: „Blood Direct“ PGR rinkinys gali sustiprinti iki 4 kb ilgio fragmentus, o tai rodo, kad jis gali sustiprinti ilgus fragmentus.
	Naudojant žmogaus EDTA antikoaguliaciją kaip šabloną, „Blood Direct“ PGR rinkinys buvo naudojamas įvairių kraujo mėginių PGR aptikimui. PGR reakcijos sistema buvo 20 μl, o kaip šablonas buvo naudojamas 1 μl kraujo. M: TIANGEN žymeklis II; 1-9: kraunamasis kraujo kiekis yra atitinkamai 0,1 μl, 0,2 μl, 0,3 μl, 0,4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl ir 5 μl; NTC: valdymas be šablono Eksperimentiniai rezultatai: „Blood Direct“ PGR rinkinys turi stiprų atsparumą kraujui ir gali padidinti kraujo mėginius, kai pakrovimo intervalas yra 0,1–5 μl.
	Žmonių, žiurkių, vištų ir kitų rūšių kraujo mėginiai, naudojami skirtingai, buvo naudojami kaip šablonai. „Blood Direct“ PGR rinkinys buvo naudojamas PRNP (žmogaus, 750 bp), aktino (žiurkė, 200 bp) ir β-aktino (vištiena, 1,0 kb) amplifikavimui. PGR reakcijos sistema buvo 20 μl, o kaip šablonas buvo naudojamas 1 μl kraujo. M: TIANGEN žymeklis II. Eksperimentiniai rezultatai: „Blood Direct“ PGR rinkinys gali būti naudojamas įvairiems mėginiams, o tiesioginis PGR aptikimas gali būti atliktas iš įvairių rūšių kraujo mėginių, skirtingai gydant.

Klausimas: Nėra stiprinimo juostų

A-1 šablonas

■ Šablone yra baltymų priemaišų arba Taq inhibitorių ir kt. - Išvalykite DNR šabloną, pašalinkite baltymų priemaišas arba ištraukite šablono DNR su valymo rinkiniais.

■ Šablono denatūracija nėra baigta —— Tinkamai padidinkite denatūracijos temperatūrą ir pailginkite denatūracijos laiką.

■ Šablono pablogėjimas-iš naujo paruoškite šabloną.

A-2 gruntas

■ Prasta pradmenų kokybė-pakartotinai sintezuokite pradmenis.

■ Grunto skaidymas —— Konservuoti didelės koncentracijos pradmenis į mažą tūrį. Venkite daugkartinio užšalimo ir atšildymo arba ilgalaikio 4 ° C šalčio.

■ Netinkamas gruntų dizainas (pvz., Nepakankamas grunto ilgis, tarp pradmenų susidaręs dimeris ir pan.)

A-3 Mg²⁺koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija yra per maža - tinkamai padidinkite Mg²⁺koncentracija: optimizuokite Mg²⁺ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg²⁺ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.

A-4 atkaitinimo temperatūra

■ Aukšta atkaitinimo temperatūra turi įtakos grunto ir šablono surišimui. —— Sumažinkite atkaitinimo temperatūrą ir optimizuokite būklę 2 ° C gradientu.

A-5 Pratęsimo laikas

■ Trumpas pratęsimo laikas - padidinkite pratęsimo laiką.

Klausimas: klaidingai teigiamas

Fenomenai: neigiami mėginiai taip pat rodo tikslines sekos juostas.

A-1 PGR užteršimas

■ Tikslinės sekos arba amplifikacijos produktų kryžminis užteršimas - atsargiai nepipipiliuokite mėginyje esančio mėginio, kuriame yra tikslinė seka, ir neišpilkite jų iš centrifugos mėgintuvėlio. Reagentai ar įranga turi būti autoklavuojami, kad būtų pašalintos esamos nukleorūgštys, o užterštumas turėtų būti nustatytas atliekant neigiamus kontrolinius eksperimentus.

■ Reagentų užteršimas —— Reagentus išplakite ir laikykite žemoje temperatūroje.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentracija yra per maža - tinkamai padidinkite Mg²⁺ koncentracija: optimizuokite Mg²⁺ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg²⁺ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.

■ Netinkamas pradmenų dizainas ir tikslinė seka yra homologiška su netiksline seka. —— Iš naujo suprojektuoti gruntai.

Klausimas: nespecifinis stiprinimas

Reiškiniai: PGR amplifikacijos juostos neatitinka tikėtino dydžio, didelės arba mažos, arba kartais atsiranda tiek specifinių amplifikacijos juostų, tiek nespecifinių amplifikacijos juostų.

A-1 gruntas

■ Prastas grunto specifiškumas

—— naujo dizaino gruntas.

■ Grunto koncentracija yra per didelė —— Tinkamai padidinkite denatūracijos temperatūrą ir pailginkite denatūracijos laiką.

A-2 Mg²⁺ koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija yra per didelė —— Tinkamai sumažinkite Mg2+ koncentraciją: optimizuokite Mg²⁺ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg²⁺ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.

A-3 Termostabili polimerazė

■ Per didelis fermentų kiekis - atitinkamai sumažinkite fermentų kiekį 0,5 V intervalu.

A-4 atkaitinimo temperatūra

■ Atkaitinimo temperatūra yra per žema —— Tinkamai padidinkite atkaitinimo temperatūrą arba naudokite dviejų pakopų atkaitinimo metodą

A-5 PGR ciklai

■ Per daug PGR ciklų - sumažinkite PGR ciklų skaičių.

Kl.: Pleistrios arba suteptos juostos

A-1 gruntas—— prasta specifika —— iš naujo suprojektuokite gruntą, pakeiskite grunto vietą ir ilgį, kad padidintumėte jo specifiškumą; arba atlikti įdėtąjį PGR.

A-2 šablono DNR

—–Šablonas nėra grynas —— Išvalykite šabloną arba ištraukite DNR valymo rinkiniais.

A-3 Mg²⁺ koncentracija

- Mg²⁺ koncentracija yra per didelė - tinkamai sumažinkite Mg²⁺ koncentracija: optimizuokite Mg²⁺ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg²⁺ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.

A-4 dNTP

——DNTP koncentracija per didelė —— Tinkamai sumažinkite dNTP koncentraciją

A-5 atkaitinimo temperatūra

—— Per maža atkaitinimo temperatūra —— Tinkamai padidinkite atkaitinimo temperatūrą

A-6 ciklai

—— Per daug ciklų —— Optimizuokite ciklo skaičių

Klausimas: Kiek šablono DNR reikia pridėti į 50 μl PGR reakcijos sistemą?

Kl.: Kaip sustiprinti ilgus fragmentus?

Pirmasis žingsnis yra pasirinkti tinkamą polimerazę. Įprasta Taq polimerazė negali būti koreguojama, nes trūksta 3'-5 'eksonukleazės aktyvumo, o neatitikimas labai sumažins fragmentų išplėtimo efektyvumą. Todėl įprasta Taq polimerazė negali efektyviai sustiprinti didesnių nei 5 kb tikslinių fragmentų. Taq polimerazė su specialia modifikacija arba kita aukštos tikslumo polimerazė turėtų būti parenkama taip, kad pagerintų pratęsimo efektyvumą ir patenkintų ilgo fragmento amplifikacijos poreikius. Be to, norint sustiprinti ilgus fragmentus, taip pat reikia atitinkamai pakoreguoti pradmenų konstrukciją, denatūracijos laiką, pratęsimo laiką, buferio pH ir tt Paprastai gruntai su 18-24 bp gali duoti geresnį derlių. Siekiant išvengti šablono pažeidimo, denatūracijos laikas 94 ° C temperatūroje per ciklą turėtų būti sutrumpintas iki 30 sekundžių ar mažiau, o laikas iki temperatūros padidėjimo iki 94 ° C iki amplifikacijos turėtų būti trumpesnis nei 1 min. Be to, nustačius pratęsimo temperatūrą apie 68 ° C ir pailginimo laiką suprojektuojant pagal 1 kb/min greitį, galima užtikrinti veiksmingą ilgų fragmentų amplifikaciją.

Kl.: Kaip pagerinti PCR amplifikacijos tikslumą?

PGR amplifikacijos klaidų dažnį galima sumažinti naudojant labai tikslias įvairias DNR polimerazes. Tarp visų iki šiol rastų Taq DNR polimerazių Pfu fermentas turi mažiausią klaidų lygį ir didžiausią ištikimybę (žr. Pridedamą lentelę). Be fermentų atrankos, mokslininkai gali dar labiau sumažinti PGR mutacijos greitį, optimizuodami reakcijos sąlygas, įskaitant buferio sudėties optimizavimą, termiškai stabilios polimerazės koncentraciją ir optimizuojant PGR ciklo skaičių.

Parašykite savo pranešimą čia ir atsiųskite mums