2 × „Taq Platinum PCR Mix“
Veiklos apibrėžimas
1 vienetas (U) Taq platinos DNR polimerazės aktyvumas apibrėžiamas kaip fermento kiekis, kurio reikia, kad į rūgštyje netirpias medžiagas 74 ° C temperatūroje per 30 minučių būtų įterpta 10 nmol deoksinukleotidų, naudojant šabloną/pradmenį suaktyvintą lašišos spermos DNR.
Kokybės kontrolė
SDS-PAGE aptikimo grynumas yra didesnis nei 99%; Egzogeninio nukleazės aktyvumo neaptinkama; Vienos kopijos genas žmogaus genome galėtų būti efektyviai sustiprintas; Savaitę laikant kambario temperatūroje, reikšmingi veiklos pokyčiai nesikeičia.
Pagrindiniai techniniai parametrai
Jis turi 5'-3 'eksonukleazės aktyvumą ir 3'-5' eksonukleazės aktyvumą, o jo ištikimybė yra šalia Pfu polimerazės. Taq platinos polimerazės pratęsimo greitis yra greitesnis nei Pfu polimerazės, o stiprinimo efektyvumas yra didesnis. PGR produktai gali būti tiesiogiai surišti į buką galą arba klonuoti TA vektoriumi. Jei reikia pagerinti klonavimo efektyvumą, prieš klonavimą į TA vektorių rekomenduojama pirmiausia išvalyti ir pridėti 3'-dA iškyšas.
Vieno vamzdžio „Taq Platinum MasterMix“ (nacionalinis aukštųjų technologijų produktų sertifikatas)
■ „Taq Platinum MasterMix“ pagerino PGR reakcijos specifiškumą ir jautrumą ir gali sustiprinti sudėtingus šablonus su dideliu GC kiekiu, antrine struktūra ir pan. Galima padidinti tik 2 tikslinio šablono kopijas, užtikrinant tikslesnius eksperimentinius rezultatus.
■ Dėl unikalios „Taq Platinum MasterMix“ formulės visa reakcijos sistema tampa labai stabili, o aktyvumui įtakos nedarys pakartotinis užšalimas-atšildymas ar ilgalaikis laikymas 4 ° C temperatūroje.
■ Stabilus ir efektyvus iš anksto paruoštas PGR mišinys gali padaryti operaciją greitą ir paprastą, labai sumažindamas darbo intensyvumą ir mėginių ėmimo klaidas. Į mišinį taip pat įtrauktas didelio našumo PGR stipriklis ir optimizatorius, kuris sumažina PGR sąlygų reikalavimus.
■ Šiame gaminyje yra ir dažų turinčių, ir be dažiklių sistemų. Dažų turintys „MasterMix“ produktai gali būti tiesiogiai elektroforezuojami po PGR, nepridedant pakrovimo buferio.
Programos
Jis gali pakeisti Pfu polimerazę, kad sustiprintų aukštos kokybės produktus iš sudėtingų šablonų, tokių kaip genomai, ir tinka tokioms reikmėms kaip ekspresijos genų klonavimas, konkrečiai vietai būdingos mutacijos ir vieno nukleotido polimorfizmo (SNP) analizė ir kt.
Atsargumo priemonės projektuojant PGR gruntus:
Grunto ilgis paprastai yra 20-25 merai. Tačiau atliekant ilgo fragmento PGR, pradmenų ilgis turėtų būti padidintas iki 30–35 mer.
■ Nėra papildomo suporavimo tarp dviejų pradmenų, ypač paskutinėms 3 bazėms 3 ′ gale.
■ GC kiekis turėtų būti 50–60%ir vengti vietinio turtingo GC ar AT. Kad gruntas ir šablonas stabiliai surištų, venkite turtingos AT struktūros 3 ′ gale.
■ Venkite grunto, kad susidarytumėte antrinę struktūrą.
■ Pasirinkite du gruntus, kurių Tm temperatūra yra arti vienas kito.
PGR pradmenų Tm vertės apskaičiavimas:
■ Kai gruntas yra mažesnis nei 20 merų: Tm = 2 ° C × (A+T)+4 ° C × (G+C).
■ Kai gruntas yra didesnis nei 20 merų: Tm = 81,5+0,41 × (GC%)-600/L, kur L yra grunto ilgis.
■ Nustatykite atkaitinimo temperatūrą (Tm-5) ° C.
PGR grunto įvestis
Tinkamą galutinę pradmenų koncentraciją galima pasirinkti nuo 0,1 μM iki 1,0 μM. Per maža pradmenų koncentracija lemia mažą amplifikacijos produktų išeigą, o per didelė pradmenų koncentracija yra labiau linkusi į nespecifinį amplifikaciją. Paprastai, kai šablono DNR kiekis yra didelis arba kaip šablonas naudojamas sudėtingas šablono DNR (pvz., Žmogaus genomo DNR), pradmenų koncentracija turėtų būti mažesnė. Kai šablono DNR kiekis yra mažas arba kaip šablonas naudojamas paprastas šablono DNR (pvz., Plazmidės DNR ir kt.), Pradmenų koncentracija turėtų būti didesnė.
Visi produktai gali būti pritaikyti ODM/OEM. Norėdami gauti daugiau informacijos,spustelėkite individualų aptarnavimą (ODM/OEM)
  |
Naudokite genominę DNR kaip šabloną, kad sustiprintumėte 1 kb fragmentą. Po PGR reakcijos paimkite 5 μl elektroforezės aptikimui. |
A-1 šablonas
■ Šablone yra baltymų priemaišų arba Taq inhibitorių ir kt. - Išvalykite DNR šabloną, pašalinkite baltymų priemaišas arba ištraukite šablono DNR su valymo rinkiniais.
■ Šablono denatūracija nėra baigta —— Tinkamai padidinkite denatūracijos temperatūrą ir pailginkite denatūracijos laiką.
■ Šablono pablogėjimas-iš naujo paruoškite šabloną.
A-2 gruntas
■ Prasta pradmenų kokybė-pakartotinai sintezuokite pradmenis.
■ Grunto skaidymas —— Konservuoti didelės koncentracijos pradmenis į mažą tūrį. Venkite daugkartinio užšalimo ir atšildymo arba ilgalaikio 4 ° C šalčio.
■ Netinkamas gruntų dizainas (pvz., Nepakankamas grunto ilgis, tarp pradmenų susidaręs dimeris ir pan.)
A-3 Mg2+koncentracija
■ Mg2+ koncentracija yra per maža - tinkamai padidinkite Mg2+ koncentracija: optimizuokite Mg2+ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg2+ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.
A-4 atkaitinimo temperatūra
■ Aukšta atkaitinimo temperatūra turi įtakos grunto ir šablono surišimui. —— Sumažinkite atkaitinimo temperatūrą ir optimizuokite būklę 2 ° C gradientu.
A-5 Pratęsimo laikas
■ Trumpas pratęsimo laikas - padidinkite pratęsimo laiką.
Fenomenai: neigiami mėginiai taip pat rodo tikslines sekos juostas.
A-1 PGR užteršimas
■ Tikslinės sekos arba amplifikacijos produktų kryžminis užteršimas - atsargiai nepipipiliuokite mėginyje esančio mėginio, kuriame yra tikslinė seka, ir neišpilkite jų iš centrifugos mėgintuvėlio. Reagentai ar įranga turi būti autoklavuojami, kad būtų pašalintos esamos nukleorūgštys, o užterštumas turėtų būti nustatytas atliekant neigiamus kontrolinius eksperimentus.
■ Reagentų užteršimas —— Reagentus išplakite ir laikykite žemoje temperatūroje.
A-2 Primer
■ Mg2+ koncentracija yra per maža - tinkamai padidinkite Mg2+ koncentracija: optimizuokite Mg2+ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg2+ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.
■ Netinkamas pradmenų dizainas ir tikslinė seka yra homologiška su netiksline seka. —— Iš naujo suprojektuoti gruntai.
Reiškiniai: PGR amplifikacijos juostos neatitinka tikėtino dydžio, didelės arba mažos, arba kartais atsiranda tiek specifinių amplifikacijos juostų, tiek nespecifinių amplifikacijos juostų.
A-1 gruntas
■ Prastas grunto specifiškumas
—— naujo dizaino gruntas.
■ Grunto koncentracija yra per didelė —— Tinkamai padidinkite denatūracijos temperatūrą ir pailginkite denatūracijos laiką.
A-2 Mg2+ koncentracija
■ Mg2+ koncentracija yra per didelė —— Tinkamai sumažinkite Mg2+ koncentraciją: optimizuokite Mg2+ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg2+ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.
A-3 Termostabili polimerazė
■ Per didelis fermentų kiekis - atitinkamai sumažinkite fermentų kiekį 0,5 V intervalu.
A-4 atkaitinimo temperatūra
■ Atkaitinimo temperatūra yra per žema —— Tinkamai padidinkite atkaitinimo temperatūrą arba naudokite dviejų pakopų atkaitinimo metodą
A-5 PGR ciklai
■ Per daug PGR ciklų - sumažinkite PGR ciklų skaičių.
A-1 gruntas—— prasta specifika —— iš naujo suprojektuokite gruntą, pakeiskite grunto vietą ir ilgį, kad padidintumėte jo specifiškumą; arba atlikti įdėtąjį PGR.
A-2 šablono DNR
—–Šablonas nėra grynas —— Išvalykite šabloną arba ištraukite DNR valymo rinkiniais.
A-3 Mg2+ koncentracija
- Mg2+ koncentracija yra per didelė - tinkamai sumažinkite Mg2+ koncentracija: optimizuokite Mg2+ koncentracija atliekant reakcijų seriją nuo 1 mM iki 3 mM su 0,5 mM intervalu, siekiant nustatyti optimalų Mg2+ kiekvieno šablono ir pradmenų koncentracija.
A-4 dNTP
——DNTP koncentracija per didelė —— Tinkamai sumažinkite dNTP koncentraciją
A-5 atkaitinimo temperatūra
—— Per maža atkaitinimo temperatūra —— Tinkamai padidinkite atkaitinimo temperatūrą
A-6 ciklai
—— Per daug ciklų —— Optimizuokite ciklo skaičių
Pirmasis žingsnis yra pasirinkti tinkamą polimerazę. Įprasta Taq polimerazė negali būti koreguojama, nes trūksta 3'-5 'eksonukleazės aktyvumo, o neatitikimas labai sumažins fragmentų išplėtimo efektyvumą. Todėl įprasta Taq polimerazė negali efektyviai sustiprinti didesnių nei 5 kb tikslinių fragmentų. Taq polimerazė su specialia modifikacija arba kita aukštos tikslumo polimerazė turėtų būti parenkama taip, kad pagerintų pratęsimo efektyvumą ir patenkintų ilgo fragmento amplifikacijos poreikius. Be to, norint sustiprinti ilgus fragmentus, taip pat reikia atitinkamai pakoreguoti pradmenų konstrukciją, denatūracijos laiką, pratęsimo laiką, buferio pH ir tt Paprastai gruntai su 18-24 bp gali duoti geresnį derlių. Siekiant išvengti šablono pažeidimo, denatūracijos laikas 94 ° C temperatūroje per ciklą turėtų būti sutrumpintas iki 30 sekundžių ar mažiau, o laikas iki temperatūros padidėjimo iki 94 ° C iki amplifikacijos turėtų būti trumpesnis nei 1 min. Be to, nustačius pratęsimo temperatūrą apie 68 ° C ir pailginimo laiką suprojektuojant pagal 1 kb/min greitį, galima užtikrinti veiksmingą ilgų fragmentų amplifikaciją.
PGR amplifikacijos klaidų dažnį galima sumažinti naudojant labai tikslias įvairias DNR polimerazes. Tarp visų iki šiol rastų Taq DNR polimerazių Pfu fermentas turi mažiausią klaidų lygį ir didžiausią ištikimybę (žr. Pridedamą lentelę). Be fermentų atrankos, mokslininkai gali dar labiau sumažinti PGR mutacijos greitį, optimizuodami reakcijos sąlygas, įskaitant buferio sudėties optimizavimą, termiškai stabilios polimerazės koncentraciją ir optimizuojant PGR ciklo skaičių.
Produktų kategorijos
KODĖL RINKTIS MUS
Nuo pat įkūrimo mūsų gamykla kuria pirmos pasaulinės klasės produktus, laikydamasi principo
pirmiausia kokybe. Mūsų produktai įgijo puikią reputaciją pramonėje ir patikimumą tarp naujų ir senų klientų.
- Tel: +86 010-59822688
- 5 pastatas, Nr. 86, Shuangying West Road, Changping rajonas, Pekinas.
- people@tiangen.com
